流式細(xì)胞儀是怎么運(yùn)行的

流式細(xì)胞儀的分選功能是由細(xì)胞分選器來完成的?？偟倪^程是：由噴嘴射出的液柱被分割成一連串的小水滴，根據(jù)選定的某個(gè)參數(shù)由邏輯電路判明是否將被分選，而后由充電電路對(duì)選定細(xì)胞液滴充電，帶電液滴攜帶細(xì)胞通過靜電場(chǎng)而發(fā)生偏轉(zhuǎn)，落入收集器中；其它液體被當(dāng)作廢液抽吸掉，某些類型的儀器也有采用捕獲管來進(jìn)行分選的。穩(wěn)定的小液滴是由流動(dòng)室上的壓電晶體在幾十KHz的電信號(hào)作用下發(fā)生振動(dòng)而迫使液流均勻斷裂而形成的。一般液滴間距約數(shù)百μm。實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)公式f=v/4.5d給出形成穩(wěn)定水滴的振蕩信號(hào)頻率。其中v是液流速度，d為噴孔直徑。由此可知使用不同孔徑的噴孔及改變液流速度，可能會(huì)改變分選效果。使分選的含細(xì)胞液滴在靜電場(chǎng)中的偏轉(zhuǎn)是由充電電路和偏轉(zhuǎn)板共同完成的。

充電電壓一般選+150V，或-150V；偏轉(zhuǎn)板間的電位差為數(shù)千伏。充電電路中的充電脈沖發(fā)生器是由邏輯電路控制的，因此從參數(shù)測(cè)定經(jīng)邏輯選擇再到脈沖充電需要一段延遲時(shí)間，一般為數(shù)十ms。測(cè)定延遲時(shí)間是決定分選質(zhì)量的關(guān)鍵，儀器多采用移位寄存器數(shù)字電路來產(chǎn)生延遲?？筛鶕?jù)具體要求予以適當(dāng)調(diào)整。（50）數(shù)據(jù)處理原理：FCM的數(shù)據(jù)處理主要包括數(shù)據(jù)的顯示和分析，至于對(duì)儀器給出的結(jié)果如何解釋則隨所要解決的具體問題而定。①數(shù)據(jù)顯示：FCM的數(shù)據(jù)顯示方式包括單參數(shù)直方圖、二維點(diǎn)圖、二維等高圖、假三維圖和列表模式等。

直方圖是一維數(shù)據(jù)用作的圖形顯示形式，既可用于定性分析，又可用于定量分析，形同一般X—Y平面描圖儀給出的曲線。根據(jù)選擇放大器類型不同，坐標(biāo)可以是線性標(biāo)度或?qū)?shù)標(biāo)度，用“道數(shù)”來表示,實(shí)質(zhì)上是所測(cè)的熒光或散射光的強(qiáng)度。坐標(biāo)一般表示的是細(xì)胞的相對(duì)數(shù)。圖10-2給出的是直方圖形式。只能顯示一個(gè)參數(shù)與細(xì)胞之間的關(guān)系是它的局限性。二維點(diǎn)圖能夠顯示兩個(gè)獨(dú)立參數(shù)與細(xì)胞相對(duì)數(shù)之間的關(guān)系。坐標(biāo)和坐標(biāo)分別為與細(xì)胞有關(guān)的兩個(gè)獨(dú)立參數(shù)，平面上每一個(gè)點(diǎn)表示同時(shí)具有相應(yīng)坐標(biāo)值的細(xì)胞存在（圖10-3）。

可以由二維點(diǎn)圖得到兩個(gè)一維直方圖，但是由于兼并現(xiàn)象存在，二維點(diǎn)圖的信息量要大于二個(gè)一維直方圖的信息量。所謂兼并就是說多個(gè)細(xì)胞具有相同的二維坐標(biāo)在圖上只表現(xiàn)為一個(gè)點(diǎn)，這樣對(duì)細(xì)胞點(diǎn)密集的地方就難于顯示它的精細(xì)結(jié)構(gòu)。經(jīng)熒光染色的細(xì)胞受合適的光激發(fā)后所產(chǎn)生的熒光是通過光電轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)變成電信號(hào)而進(jìn)行測(cè)量的。光電倍增管（PMT）為常用。PMT的響應(yīng)時(shí)間短，僅為ns數(shù)量級(jí)；光譜響應(yīng)特性好，在200～900nm的光譜區(qū)，光量子產(chǎn)額都比較高。光電倍增管的增益從10到10可連續(xù)調(diào)節(jié)　，因此對(duì)弱光測(cè)量十分有利。

光電管運(yùn)行時(shí)特別要注意穩(wěn)定性問題，工作電壓要十分穩(wěn)定，工作電流及功率不能太大。一般功耗低于0.5W；陽極電流在幾個(gè)毫安。此外要注意對(duì)光電管進(jìn)行暗適應(yīng)處理，并注意良好的磁屏蔽。在使用中還要注意安裝位置不同的PMT，因?yàn)楣庾V響應(yīng)特性不同，不宜互換。也有用硅光電二極管的，它在強(qiáng)光下穩(wěn)定性比PMT好。從PMT輸出的電信號(hào)仍然較弱，需要經(jīng)過放大后才能輸入分析儀器。

流式細(xì)胞計(jì)中一般備有兩類放大器。一類是輸出信號(hào)輻度與輸入信號(hào)成線性關(guān)系，稱為線性放大器。線性放大器適用于在較小范圍內(nèi)變化的信號(hào)以及代表生物學(xué)線性過程的信號(hào)，例DNA測(cè)量等。另一類是對(duì)數(shù)放大器，輸出信號(hào)和輸入信號(hào)之間成常用對(duì)數(shù)關(guān)系。在免疫學(xué)測(cè)量中常使用對(duì)數(shù)放大器。因?yàn)樵诿庖叻治鰰r(shí)常要同時(shí)顯示陰性、陽性和強(qiáng)陽性三個(gè)亞群，它們的熒光強(qiáng)度相差1～2個(gè)數(shù)量級(jí)；而且在多色免疫熒光測(cè)量中，用對(duì)數(shù)放大器采集數(shù)據(jù)易于解釋。此外還有調(diào)節(jié)　便利、細(xì)胞群體分布形狀不易受外界工作條件影響等優(yōu)點(diǎn)。

低壓制備色譜通常有兩種模式，一種是在柱上方加壓，另一種是在柱下方減壓。除了加減壓外，其他的與經(jīng)典柱色譜法基本一致。減壓一般是用真空泵來完成，加壓一般用空氣泵氮?dú)怃撈咳鋭?dòng)泵等完成。在低壓制備色譜中使用的是顆粒較大的填料，因此其分辨率是有限的?！　≈袎褐苽渖V是利用恒流泵抽送流動(dòng)相，帶著樣品流經(jīng)色譜柱，實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的分離。中壓制備色譜系統(tǒng)由溶劑瓶、恒流泵、進(jìn)樣閥、色譜柱、檢測(cè)器、記錄儀和餾分收集器等部分組成。其色譜柱一般是由耐壓的強(qiáng)化玻璃制成，填料顆粒大小比低壓制備色譜所用填料小，分離效率更高。