小動(dòng)物活體熒光成像技術(shù)在國(guó)內(nèi)外得到越來(lái)越的普及應(yīng)用，越來(lái)越多的科研人員希望能通過(guò)該技術(shù)來(lái)長(zhǎng)時(shí)間追蹤觀察活體動(dòng)物體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)以及對(duì)藥物治療的反應(yīng)，希望能觀察到熒光標(biāo)記的多肽、抗體、小分子藥物在體內(nèi)的分布和代謝情況。
與傳統(tǒng)技術(shù)相比，活體熒光成像技術(shù)不需要?dú)⑺绖?dòng)物，可以對(duì)同一個(gè)動(dòng)物進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間反復(fù)跟蹤成像，既可以提高數(shù)據(jù)的可比性，避免個(gè)體差異對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響；又可以了解標(biāo)記物在動(dòng)物體內(nèi)的分布和代謝情況，避免傳統(tǒng)體外實(shí)驗(yàn)方法的諸多缺點(diǎn)；特別是還可以用原生態(tài)的方法來(lái)研究問(wèn)題，即研究對(duì)象不需要先行標(biāo)記，其后用熒光標(biāo)記物來(lái)研究其行為，觀察結(jié)果真實(shí)可靠。
那如何選擇自己最合適的活體熒光成像系統(tǒng)呢？本文試從以下幾點(diǎn)來(lái)進(jìn)行分析。
1、 熒光標(biāo)記的選擇
活體熒光成像技術(shù)主要有三種標(biāo)記方法：熒光蛋白標(biāo)記、熒光染料標(biāo)記和量子點(diǎn)標(biāo)記。熒光蛋白適用于標(biāo)記腫瘤細(xì)胞、病毒、基因等。通常使用的是GFP、EGFP、RFP（DsRed）等。熒光染料標(biāo)記和體外標(biāo)記方法相同，常用的有Cy3、Cy5、Cy5.5及Cy7，可以標(biāo)記抗體、多肽、小分子藥物等。量子點(diǎn)標(biāo)記作為一種新的標(biāo)記方法，是有機(jī)熒光染料的發(fā)射光強(qiáng)的20倍，穩(wěn)定性強(qiáng)100倍以上，具有熒光發(fā)光光譜較窄、量子產(chǎn)率高、不易漂白、激發(fā)光譜寬、顏色可調(diào)，并且光化學(xué)穩(wěn)定性高，不易分解等諸多優(yōu)點(diǎn)。量子點(diǎn)是一種能發(fā)射熒光的半導(dǎo)體納米微晶體，尺寸在100nm以下，它可以經(jīng)受反復(fù)多次激發(fā)，而不像有機(jī)熒光染料那樣容易發(fā)生熒光淬滅。
但是不同熒光波長(zhǎng)的組織穿透力不同，如圖1所示，各種波長(zhǎng)的光對(duì)小鼠各種器官的透過(guò)率，都在波長(zhǎng)>600nm時(shí)顯著增加。而如圖2所示，在650nm-900nm的近紅外區(qū)間，血紅蛋白、脂肪和水對(duì)這些波長(zhǎng)的光的吸收都保持在一個(gè)比較低的水平。因而，選擇激發(fā)和發(fā)射光譜位于650nm-900nm的近紅外熒光標(biāo)記（或至少發(fā)射光譜位于該區(qū)間），更有利于活體光學(xué)成像，特別是深層組織的熒光成像。（推薦文獻(xiàn)： Nature Method, 2005, 2: 12 如何選擇合適的熒光蛋白； Science, 2009, 324: 804 錢(qián)永建教授研究成果-近紅外熒光蛋白，非常適合活體熒光成像）。
2、 活體熒光成像CCD的選擇
選擇適當(dāng)?shù)腃CD鏡頭，對(duì)于體內(nèi)可見(jiàn)光成像是非常重要的。如何選擇活體熒光性價(jià)比最高的CCD呢？CCD有一些重要的參數(shù)：
1) CCD 像素。CCD像素決定成像的圖片質(zhì)量，像素越高，成像質(zhì)量越好。由于熒光背景光較強(qiáng)，產(chǎn)生非特異性雜光干擾明顯，需要配有高分辨率CCD的相機(jī)。
2) 前照式還是背照式CCD。一般而言，背照式CCD具有更高的量子效率，但是只有在檢測(cè)極弱光信號(hào)優(yōu)勢(shì)明顯（如活體生物發(fā)光成像），但在強(qiáng)光檢測(cè)中與前照式CCD無(wú)本質(zhì)差別，還更容易光飽和，并且其成本較高的弱勢(shì)使其不屬于熒光檢測(cè)常規(guī)要素。
3) CCD 溫度。制冷CCD分為兩種：恒定低溫制冷CCD和相對(duì)低溫制冷CCD。恒定低溫制冷CCD擁有穩(wěn)定的背景，可以進(jìn)行背景扣除；而相對(duì)低溫制冷CCD由于背景不穩(wěn)定，一般不能進(jìn)行有效的背景扣除。CCD制冷溫度越低，產(chǎn)生的暗電流越小，如圖3所示，當(dāng)制冷溫度達(dá)到-29℃時(shí)，產(chǎn)生的暗電流已經(jīng)低至0.03e/pixel/s。由于儀器自身產(chǎn)生的噪音主要由暗電流熱噪音和CCD讀取噪音組成，而目前CCD讀取噪音最低只能降至2e rms；因而更低溫度的CCD并不能明顯的降低背景噪音，而成本卻極大提高。
4) CCD 讀取噪音和暗電流。CCD讀取噪音和暗電流熱噪音是成像系統(tǒng)產(chǎn)生背景噪音的主要因素，但是 在熒光成像中，最主要的背景噪音卻是來(lái)自于熒光背景光。熒光成像信噪比的改善主要依賴于熒光背景光的有效控制和背景扣除技術(shù)（圖4）。
3 、自發(fā)熒光的干擾
在活體熒光成像中，動(dòng)物自發(fā)熒光一直困擾著科研工作者。在擁有激發(fā)光多光譜分析功能的活體成像系統(tǒng)出現(xiàn)以前，科學(xué)家們被迫采取各種方法來(lái)減少動(dòng)物自發(fā)熒光，比如：采用無(wú)熒光素鼠糧飼養(yǎng)小鼠、使用裸鼠等?，F(xiàn)在，擁有激發(fā)光多光譜分析功能的活體成像系統(tǒng)，能夠輕松進(jìn)行熒光信號(hào)的拆分，如圖5，食物、膀胱、毛發(fā)和皮膚的自發(fā)熒光能夠被有效的區(qū)分和剝離。激發(fā)光多光譜分析也可用于多重?zé)晒鈽?biāo)記檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)一鼠多標(biāo)記，降低實(shí)驗(yàn)成本，并有效提高數(shù)據(jù)的可比性。
4、 熒光信號(hào)的準(zhǔn)確定位
如圖6所示，如果信號(hào)和靶標(biāo)100%重合，這是科學(xué)家所追求的；但是，如果信號(hào)并不和靶標(biāo)重合，而又誤以為正確定位時(shí)，這是科學(xué)的噩夢(mèng)。也許，一個(gè)錯(cuò)誤定位的信號(hào)，比沒(méi)有信號(hào)更加糟糕！
而同時(shí)擁有結(jié)構(gòu)成像（如X光、MRI）和功能成像功能（如熒光、發(fā)光、同位素）的多功能活體成像系統(tǒng)，則讓您擺脫困境，準(zhǔn)確定位熒光信號(hào)。如圖7所示，小鼠的X成像經(jīng)過(guò)胃腸造影，可清晰地獲得胃腸的形狀和位置，將熒光信號(hào)和X光疊加，熒光和胃腸重合，可準(zhǔn)確判定熒光定位在胃腸。
